實驗1 大腸桿菌的培養和分離
——基礎知識和操作過程梳理
一、大腸桿菌
細菌是單細胞的原核生物。細菌細胞的結構有細胞壁、細胞膜、細胞質等。細菌無成型的細胞核，細胞壁由肽聚糖組成。由于細菌細胞壁結構不同，細菌可分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩類。革蘭氏陽性菌細胞壁厚，無莢膜，多產生外毒素；革蘭氏陰性菌細胞壁薄，有莢膜，多產生內毒素。革蘭氏陽性菌對青霉素更為敏感。
大腸桿菌是革蘭氏陰性、異養兼性厭氧型腸道桿菌。在腸道中一般對人無害，但任何大腸桿菌進入人的泌尿系統，都會對人體產生危害。大腸桿菌在基因工程技術中被廣泛的應用，它的質粒是最常用的運載體，它也是基因工程中常用的受體細胞。
二、培養基配置
微生物生命活動過程中需要的化合物有碳源、氮源、生長因子、無機鹽和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生長因子是微生物生長不可缺少的微量有機物，但不一定需要外界補充，有的微生物可以自身合成。在提供上述幾種主要營養物質的基礎上，培養基還需要滿足微生物生長對ph、特殊營養物質以及氧氣的要求。
我們一般用lb液體培養基來擴大培養大腸桿菌，培養后可在lb固體培養基上劃線分離。以下為本實驗中培養基配置步驟：
1.稱量：準確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置lb固體培養基時還需加1g瓊脂。
2.溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50ml。配置lb固體培養基時還需加瓊脂，整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。
3.調ph：用1mol/l naoh溶液調節ph至偏堿性。
4.滅菌：在兩個250ml的三角瓶中分別裝入50ml lb液體培養基和50ml lb固體培養基，加上棉塞。將培養皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內，1kg壓力滅菌15min。
5.倒平板：滅菌后，待固體培養基冷卻至60℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。其過程是：①將滅過菌的培養皿放在火焰旁，右手拿裝有培養基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；③用左手將培養皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養基倒入培養皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。
倒過來放置的目的是防止培養基冷卻過程中形成的水滴落到培養基表面。向培養皿中轉移已滅菌的培養基時，也不要把培養基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會在這些粘附培養基上繁殖，并污染皿內培養基。
三、滅菌和消毒
1.無菌技術：①對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；②將培養器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌；③為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰旁進行；④避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。
2.消毒方法：①日常生活經常用到的是煮沸消毒法；②對一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；③對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強消毒效果，然后使用紫外線進行物理消毒；④實驗操作者的雙手使用酒精進行消毒。
3.滅菌方法：①接種環、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；②培養基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。
4.比較消毒和滅菌：