實驗1 大腸桿菌的培養和分離

比較項

理化因素的作用強度

消滅微生物的數量

芽孢和孢子能否被消滅

消毒

較為溫和

部分生活狀態的微生物

不能

滅菌

強烈

全部微生物

能

5.注意事項：①實驗中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在60～80℃烘箱中除去滅菌時的水分；②物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內冷空氣，其目的是有利于鍋內溫度升高，隨后關閉排氣閥繼續加熱，加熱結束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務必降至零時打開鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸；③在用任何器皿轉接時，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺面上，接種時要在酒精燈火焰旁操作；④培養基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養皿壁上，否則容易污染；⑤接種時要膽大心細，動作快捷，這是減少污染的關鍵；⑥接種后，培養皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養基表面，水流擴散會使菌落擴散，就很難形成單菌落了。

四、細菌的分離

1.劃線分離法：用接種環蘸菌液后在含有固體培養基的培養皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細菌間的距離加大。在培養10～20h后，可由一個細菌產生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產生的后代。

其操作步驟是：將培養皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態，在火焰旁將培養皿稍微打開。在此同時，用環狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養皿內，在平板培養基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉動培養皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養皿邊緣，也不要將培養基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養。

取菌種前灼燒接種環的目的是消滅接種環上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環的目的是消滅接種環上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環的目的是防止細菌污染環境和操作者。

2.涂布分離法：先將培養的菌液稀釋，通常稀釋到10－5 ～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養皿的固體培養基上，用玻璃刮刀涂布在培養基平面上進行培養，在適當的稀釋度下，可產生相互分開的菌落。通常每個培養皿有20個以內的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養后，再做功能性實驗。

劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復雜些。細菌的兩種分離法各有優點,都可采用。

五、菌落和菌種種類的辨認

單個細菌用肉眼是看不見的，但是，當單個或少數細菌在固體培養基上大量繁殖時，便會形成一個肉眼可見的、具有一定形態結構的子細胞群體，叫做菌落。不同種類的細菌所形成的菌落在大小、形狀、顏色、光澤度、透明度等方面具有一定的特征。

細菌的菌落表面一般是光滑而濕潤的，有黏稠性，多數透明或半透明，但也有細菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細的菌絲并可產生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅實多皺，長孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環挑動；酵母菌落類似于細菌菌落，表面光滑而濕潤，有黏稠性但大多呈乳白色，少數呈紅色。如果菌落無法辨認，只有借助于顯微鏡觀察。在顯微鏡下細菌一般為桿狀、球狀和弧狀，直徑都在1um左右；放線菌菌絲是沒有橫隔的分枝絲狀體，氣生菌絲頂端分裂成串狀孢子，孢子絲有直線形、螺旋狀、彎曲式或輪生等；酵母有卵圓型或絲狀，但卵圓形細胞大于細菌，直徑約5~7um。