多聚酶鏈式反應擴增DNA片段

教學目標：
（一）知識與技能
1、了解pcr技術的基本操作
2、理解pcr的原理
3、討論pcr的應用
（二）過程與方法
在多聚酶鏈式反應擴增dna片段的實驗過程中，應避免外源dna污染，嚴格控制溫度等反應條件
（三）情感、態度與價值觀
通過對pcr實驗的操作及結果分析，培養學生嚴謹的科學態度和實事求是的科研精神
教學重點：pcr的原理和pcr的基本操作
教學難點：pcr的原理
教學過程：
（一）引入新課
在現代生物技術中，dna技術可謂是尖端技術。人類基因組計劃、基因工程、基因診斷、基因檢測、古生物鑒定等都離不開對dna分子堿基序列的分析。而分析dna堿基序列，就需要一定量的dna片段。怎樣迅速獲得足夠量的dna片段呢？今天我們來研究學習dna分子的擴增技術――pcr技術。
（二）進行新課
1.基礎知識
pcr技術擴增dna的過程，與細胞內dna復制過程類似：
1.1細胞內dna復制條件分析：
條件 組分 作用
模板 dna的兩條單鏈 提供復制的模板
原料 四種脫氧核苷酸 合成dna子鏈的原料
酶 解旋酶
dna聚合酶 打開dna雙螺旋
催化合成dna子鏈
能量 atp 為解螺旋和合成子鏈供能
引物 rna 為dna聚合酶提供合成的3’端起點
1.2細胞內dna復制過程
（1）dna的反向平行結構：（結合投影圖）
核苷酸分子的結構與方向性：（分子結構模式圖）
由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈：（模式圖，體現方向性）。
dna雙螺旋結構的反向平行結構：
（2）dna的復制過程:
解    旋：解旋酶、atp，dna兩條鏈打開，，形成兩條dna單鏈。
引物結合：在dna單鏈3’端與dna反向配對結合，確保引物3’端與dna單鏈準確配對。
dna聚合酶結合：
子鏈合成：dna聚合酶從引物3’端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。
后續加工：dna聚合酶i將引物切去，并合成空缺處的dna單鏈，再由dna連接酶將不連續的dna子鏈連接起來（半不連續合成。先導鏈，滯后鏈）
子鏈合成特點：不能從頭合成；合成方向為“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：dna聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對功能。它在每引入一個核苷酸后都要復查一次，只有堿基配對無誤后才能繼續往下聚合，它不能從頭合成。rna聚合酶沒有校對功能，因此rna的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯配可能性較大，在rna引物完成功能后即被dna聚合酶i刪去，代之以高保真的dna鏈。
［思考］dna分子能準確復制的原因有哪些？
dna雙螺旋結構提供模板；堿基互補配對；dna聚合酶的復查功能。
［思考］細胞內哪些物質是從頭合成的？rna合成、蛋白質合成。
1.3dna分子復制的人工控制
解開螺旋：在80～100℃時，dna雙螺旋打開，形成兩條dna單鏈，稱為變性。
恢復螺旋：在50℃左右時，兩條dna單鏈重新形成雙螺旋結構，稱為復性。
復制條件：緩沖液,dna模板,四種脫氧核苷酸,熱穩定dna聚合酶,兩種引物。
反應場所：pcr儀（自動溫度周期性調節）。
［思考］緩沖液相當細胞內的什么成分？（核基質）1.4pcr的反應過程

變性：在95℃時dna解旋
復性：在50℃時引物與dna單鏈結合
延伸：在72℃時合成dna子鏈（兩個引物間的序列）2.實驗操作
2.1 pcr反應體系：緩沖液、dna模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩定dna聚合酶、兩種rna引物，水