6.2 DNA片段的擴(kuò)增——PRC技術(shù)

★課題目標(biāo)（一）知識(shí)與技能1、了解pcr技術(shù)的基本操作2、理解pcr的原理3、討論pcr的應(yīng)用

   （二）過程與方法

　　在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增dna片段的實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)避免外源dna污染，嚴(yán)格控制溫度等反應(yīng)條件（三）情感、態(tài)度與價(jià)值觀    通過對pcr實(shí)驗(yàn)的操作及結(jié)果分析，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實(shí)事求是的科研精神★課題重點(diǎn)pcr的原理和pcr的基本操作★課題難點(diǎn)  　pcr的原理★教學(xué)方法    啟發(fā)式教學(xué) ★教學(xué)工具    多媒體課件★教學(xué)過程 （一）引入新課在現(xiàn)代生物技術(shù)中，dna技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類基因組計(jì)劃、基因工程、基因診斷、基因檢測、古生物鑒定等都離不開對dna分子堿基序列的分析。而分析dna堿基序列，就需要一定量的dna片段。怎樣迅速獲得足夠量的dna片段呢？今天我們來研究學(xué)習(xí)dna分子的擴(kuò)增技術(shù)――pcr技術(shù)。（二）進(jìn)行新課1.基礎(chǔ)知識(shí)pcr技術(shù)擴(kuò)增dna的過程，與細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制過程類似：1.1細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制條件分析：條件組分作用模板dna的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成dna子鏈的原料酶解旋酶dna聚合酶打開dna雙螺旋催化合成dna子鏈能量atp為解螺旋和合成子鏈供能引物rna為dna聚合酶提供合成的3’端起點(diǎn)1.2細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制過程（1）dna的反向平行結(jié)構(gòu)：（結(jié)合教材圖5－6）核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性：（分子結(jié)構(gòu)模式圖）由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈：（模式圖，體現(xiàn)方向性）。dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu)：（2）dna的復(fù)制過程:解    旋：解旋酶、atp，dna兩條鏈打開，，形成兩條dna單鏈。引物結(jié)合：在dna單鏈3’端與dna反向配對結(jié)合，確保引物3’端與dna單鏈準(zhǔn)確配對。dna聚合酶結(jié)合：子鏈合成：dna聚合酶從引物3’端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。后續(xù)加工：dna聚合酶i將引物切去，并合成空缺處的dna單鏈，再由dna連接酶將不連續(xù)的dna子鏈連接起來（半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈，滯后鏈）子鏈合成特點(diǎn)：不能從頭合成；合成方向?yàn)椤?’→3’合成”。感悟生命的神秘：dna聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對功能。它在每引入一個(gè)核苷酸后都要復(fù)查一次，只有堿基配對無誤后才能繼續(xù)往下聚合，它不能從頭合成。rna聚合酶沒有校對功能，因此rna的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯(cuò)配可能性較大，在rna引物完成功能后即被dna聚合酶i刪去，代之以高保真的dna鏈。［思考］dna分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？dna雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板；堿基互補(bǔ)配對；dna聚合酶的復(fù)查功能。［思考］細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？rna合成、蛋白質(zhì)合成。1.3dna分子復(fù)制的人工控制解開螺旋：在80～100℃時(shí)，dna雙螺旋打開，形成兩條dna單鏈，稱為變性。恢復(fù)螺旋：在50℃左右時(shí)，兩條dna單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。復(fù)制條件：緩沖液,dna模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定dna聚合酶,兩種引物。反應(yīng)場所：pcr儀（自動(dòng)溫度周期性調(diào)節(jié)）。［思考］緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？（核基質(zhì)）4.pcr的反應(yīng)過程

變性

復(fù)性

延伸
變性：在95℃時(shí)dna解旋復(fù)性：在50℃時(shí)引物與dna單鏈結(jié)合延伸：在72℃時(shí)合成dna子鏈（兩個(gè)引物間的序列）2.實(shí)驗(yàn)操作2.1 pcr反應(yīng)體系：緩沖液、dna模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定dna聚合酶、兩種rna引物，水2.2 實(shí)驗(yàn)操作步驟2.3 按照pcr反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液；（2）將pcr反應(yīng)體系50μl用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5ml）中；（3）將微量離心管放到pcr儀中；（4）設(shè)置pcr儀的工作參數(shù)。（5）dna在pcr儀中大量擴(kuò)增。2.4 水浴法：將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時(shí)間。3.實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)3.1避免外源dna污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。3.2緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。3.3每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器的槍頭。3.4混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。4.結(jié)果分析與評價(jià)4.1反應(yīng)液稀釋：取2µlpcr反應(yīng)液，添加98µl蒸餾水；2.分光光度計(jì)調(diào)零：將100µl蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計(jì)調(diào)整讀數(shù)為零。4.2將100µl反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中，測定在260nm處的光吸收值。4.3計(jì)算：dna含量＝50×光吸收值×稀釋倍數(shù)（三）課堂總結(jié)、點(diǎn)評